الفهرس يوجد فقط 14 صفحة متاحة للعرض العام
 |  | from | 144 |  |  |
| | | from | 144 | | |
المستخلص
تهدف الرسالة الى مقاومة فيروس موزيك الطماطم (ToMV) وفيروس Y البطاطس (PVY) السلالة O باستخدام مزرعة طرف المرستيم ، الحماية المتبادلة cross protection و كذلك عن طريق انتاج نباتات دخان N.tabacum صنف White Burley معدلة وراثيا بحيث تعبر عن بروتينات الغطاء للفيروسات هدف الدراسة.
و كان ملخص النتائج المتحصل عليها كالتالي:
?- تم التأكد من الفيروسين بيولوجيا حيث وجد أنهم يسببان اعراض جهازية على الدخان N.tabacum اصناف White Burley ,Turkish, Samsun ) ) كذلك على نباتات الطماطم Lycopersicon esculentum صنف Duke . سبب كلا الفيروسين بقعا محلية على Chenopodium amaranticolor ، بينما انتج PVYO اعراض جهازية على Datura metel و N.glutinosa . وجد أن D.stramonium منيع تجاه الأصابه بال PVYO .
?- تم التأكد من الفيروسين من خلال قدرتهم على انتاج الأجسام المحتواة في
سيتوبلازم خلايا بشرة الدخان و التي فحصت باستخدام الميكروسكوب الضوئي.
وجد أن ToMV يكون اجسام بلورية سداسية غير منتظمة ، بينما يكون كلا
الفيروسين اجسام محتواة امورفية و التي اكتسبت اللون الأحمر بعد الصبغ
بواسطة خليط من اخضر الميثيل و البيرونين Y .
?- سيرولوجيا تم التأكد من كلا الفيروسين باستخدام الأليزا الغير مباشرة indirect
ELISA و التي اعطت نتائج موجبه مع عصير الدخان المصاب و قد تم
الأختبار باستخدام الأمصال ألمضادة عديدة النسل polyclonal و المتخصصه
للفيروسات هدف الدراسة.
4- تم تنقية الفيروسين باستخدام الطرد المركزي المتباين و المتناهى السرعات و
كانت نقطة التفاعل النهائية للتحضيرات المنقاة ??-10 و 10- 7 باستخدام اختبار
الأصابه infectivity assay و كان 10-11 و 10-8 باستخدام الأليزا الغير
مباشره لفيروسى ToMV و PVYO على التولي. باستخدام جهاز القياس
الطيفي وجد أن محصول الفيروس النقي 66 مجم/100 جرام و 31 مجم/200
جرام اوراق مصابه بال ToMV و PVYO على التوالي. تم فحص
التحضيرات المنقاة باستخدام الميكروسكوب الأليكتروني و اظهرت الصور
عصويات صلبة (300 ×17 نانوميتر) لفيروس ToMV و خيوط مرنه
(730 ×13 نانوميتر) لفيروس PVYO .
5- باستخدام التحضيرات المنقاة تم تحضير امصال عديدة النسل لكلا الفيروسين و
ذلك بتحصين الأرانب (13 مجم من كلى الفيروسين).هدف الدراسة ببعض
الأختبارات السيرولوجية ، حيث اعطى اختبار الأنتشار المزدوج في الأجار
ترسيب واضح ، بينما اعطت اختبارات tissue & dot immunoblotting
نتيجة موجبة في صورة لون قرمزي.
7- تم تحديد الوزن الجزيئي لبروتينات الغطاء لكلا الفيروسين باستخدام تقنية
SDS-PAGE ووجد أنها 17 و 34 كيلودالتون لفيروس ToMV و PVYO
على التوالي.
8- باستخدام طريقة سانجر Sanger’s method تم تحديد التتابع النيكليوتيدي
لجينوم فيروس ToMV ووجد أنه يتكون من 6383 نيكليوتيده. باستخدام برامج
الحاسب الألي تم مقارنة التتابع هدف الدراسه بالتتابع الخاص بخمس عزلات
دوليه (من استراليا ، الصين ، اليابان ، روسيا و الولايات المتحده الأمريكيه) و
في ضؤ ذلك تم تقسيم الجينوم هدف الدراسه لثلاث جينات و هى جين انزيم
التضاعف (4850 نيكليوتيده) ، جين بروتين الحركه (794 نيكليوتيده) و جين
بروتين الغطاء (479 نيكليوتيده).
9- تبعا لأشجار النسب الوراثي phylogenetic trees تم تحديد درجة التشابه بين
العزله هدف الدراسه و العزلات الدوليه حيث وجد أن التشابه يتراوح بين 79 إلى
99 ? و 55 إلى 98 ? على مستوى الجينوم ككل و الأحماض الامينية المتوقعة
على التوالي. و كانت درجة التشابه على مستوى الجينات كل على حده تتراوح
بين 79 – 99 ? لجين بروتين الحركة و 91 – 99 ? لجين انزيم التضاعف
و 74 – 99 ? لجين بروتين الغطاء و ذلك على مستوى التتابع النيكليوتيدي و
الأحماض الأمينية على التوالي.
10-تم انتاج نبيتات plantlets و درنات بطاطس صغيره microtubers خاليه من
فيروس PVYO من خلال مزرعة القمة النامية و قد نجحت ثلاثه من واقع
عشرة قمم ناميه بطول 0?5 مم في النمو و كانت كل النبيتات الناتجه عنها خالية
من الفيروس بينما نمت خمسة قمم مرستيمية بطول 1 مم و كان اثنان منها فقط
خالية من الفيروس. في تجربة اخرى تم الدمج بين مزرعة القمة النامية و
العلاج الكيمياوى chemotherapy و ذلك على اطوال 1?5 و 2?0 مم من
القمم المرستيمية و كانت افضل نتيجة عند استخدام الريبافرين ribavirin
كمادة مضادة للفيروس بتركيز 70 مجم لكل لتر من البيئه (MS medium) حيث تم الحصول على ثمانية نبيتات خالية من الفيروس. استخدت بعد ذلك
النبيتات الخاليه من الفيروس في انتاج الدرنات الصغيره.
11-استخدت العزله PVYO تحت الدراسه و التي تسبب اعراضا خفيفه على الدخان
في حماية نباتات N.tabacum cv. White Burley من اعراض موت
الأنسجه التي تحدثها العزله PVYN و ذلك من خلال الحمايه المتبادله. لوحظ
اختفاء اعراض موت الأنسجه عند حقن PVYN بعد 3-4 أيام من حقن PVYO
، و بعد اليوم الرابع من حقن PVYN لوحظ انه لم يتمكن من اصابة الدخان حيث
اعطى نتيجة سالبة عند الكشف عنه باستخدام الأليزا الغير مباشره مع استعمال
الأجسام المضادة وحيدة النسل monoclonal antibodies .
12-تم اعداد نظام مناسب لأعادة تمايز regeneration نباتات الدخان N.tabacum
cv. White Burley على اساس تمايز الأعضاء organogenesis و من
خلال استخدام بيئة MS . وجد أن انسب نسيج لبداية المزرعه explant هو
عباره عن اجزاء من الأوراق العليا كاملة النمو. وجد أن انسب تركيزات من
منظمات النمو لعملية اعادة التمايز هى 0?1 مجم NAA × 0?8 مجم BA لكل
لتر من البيئه. وكانت افضل التركيزات لعملية استطالة السيقان هى 0?1 مجم NAA ×1?6 مجم BA لكل لتر بيئه. وجد أن بيئة MS الخاليه من منظمات
النمو هى الأنسب لعملية تكوين الجذور و كان انسب وسط لعملية اقلمة النبيتات
هو خليط من تربه:بيت موس:رمل (1:1:1).
13-زرعت explants من الأوراق العليا لنباتات الدخان على بيئة MS لأعادة
التمايز و المحضرة بتركيزات مختلفة من الكناميسين kanamycin و ذلك
لتحديد التركيز القاتل منه و الذي وجد أنه 100 مجم لكل لتر من البيئه.
14-تم عدوى ال explants بواسطة بكتريا Agrobacterium tumefaciens و
التي تحمل بلازميد pBI121 و تم التأكد من نجاح التحول الوراثي بواسطة
اختبار GUS حيث اعطى نتيجة موجبة في صورة لون أزرق.
15-عزلت جينات الغطاء البروتيني للفيروسات هدف الدراسه بواسطة IC-RT-
PCR و باسخدام بادئات تحمل تتابعات مناسبة لعمل انزيمات القطع المحدد
Restriction enzymes : SmaI & SacI و ذلك لتسهيل عملية الدمج
الوراثي cloning . بتحليل نواتج PCR على جيل الأجاروز لوحظ حزم باوزان
490 لفيروس ToMV و 815 زوج من القواعد لفيروس PVYO مما اكد
اضافة اماكن خاصة لأنزيمات القطع.
16-تم تنقية نواتج PCR من الجيل باستخدام طريقة القطع و الأذابه ، ثم تم الهضم
بواسطة الأنزيمات المستخدمة سابقا لخلق اطراف تقبل الأرتباط ligation مع
البلازميد الناقل vector plasmid (pBI121) و نقى الناتج كما سبق.
17-تم هضم البلازميد الناقل بواسطة انزيمات القطع سالفة الذكر ، و حلل الناتج على
جيل الأجاروز ليعطي حزمتان واحدة تمثل جين gus و الأخرى تمثل بقية
البلازميد المفتوح linearized vector و الجاهز للربط بالجينات الفيروسيه.
18- تم ربط الجينات الفيروسيه مع البلازميد المفتوح باستخدام انزيم الربط
T4 DNA ligase و بالتالي تكوين بلازميدات جديده constructs و التي
سميت pBI121-ToMV و pBI121-PVYO و من ثم استخدمت في
التحول الوراثي للأجروباكتريوم باستخدام طريقة التجميد و الأذابة. تم عزل
DNA من البكتريا الناميه miniprep حيث استخدم في ال PCR للتأكد من
وجود الجينات الفيروسيه ، اعطى الأختبار الحزم المتوقعه و التي تمثل جينات
الغطاء البروتيني لكلا الفيروسين.
19-استخدمت خلايا الأجروباكتريوم المعدله وراثيا في اجراء عملية التحول الوراثي
لنباتات الدخان لنقل جينات الغطاء البروتيني للفيروسات هدف الدراسه ، و تم
انتاج نبيتات من الأنسجه المعدله وراثيا تحت الظروف المناسبه لعملية اعادة
التمايز و التي حددت كما ذكر سابقا.
20-تم اثبات نجاح عملية التحول الوراثي للدخان باستخدام الأليزا الغير مباشره و
التي اعطت نتيجة موجبة تدل على قدرة النبات على التعبير عن البروتين
الفيروسي. لأثبات نجاح اندماج الجينات الفيروسيه مع الماده الوراثيه للنبات تم
عزل DNA وRNA من النباتات المعدله و ذلك لأجراء PCR وRT-PCR .
اعطى ال PCR وRT-PCR الحزم المتوقعه لجينات الغطاء الفيروسي مما يدل
على نجاح اندماج الماده الوراثيه و تكوين mRNA على التوالي.
21-تم عدوى النباتات المعدله وراثيا بفيروسات ToMV و PVYO و لوحظ أنه على
مستوى ToMV 20 ? من النباتات لم تظهر اعراض بينما 36 ? لم تظهر
اعراض بالنسبه للنباتات المحقونه بفيروس PVYO . الأختبار البيولوجي اثبت
فشل الفيروسات في اصابة النباتات سالفة الذكر حيث اعطى نتيجة سالبة.