الفهرس 
INTRODUCTIONOnly 14 pages are availabe for public view
 |  | from | 206 |  |  |
| | | from | 206 | | |
Abstract
الطماطم أحد المحاصيل الهامة التي يتم زراعتها في العالم في ثلاث عروات ( النيلي ، الصيفي والشتوي) وتعتبر الطماطم من المحاصيل ذات القيمة الغذائية العالية والتي تؤكل طازجة أو مصنعة. وتعد الطماطم مصدرا غنيا ورئيسيا لليكوبين وهو من مضادات الأكسدة التي لها العديد من الفوائد الصحية والتي من أهمها تقليل خطر الإصابة بأمراض القلب والسرطان.
وتحتل جمهورية مصر العربية المرتبة السادسة من حيث الإنتاجية والمساحة المنزرعة، حيث تنتج مصر حوالي 6 مليون و 245 ألف طن سنويا وذلك طبقا لإحصائيات منظمة الأغذية والزراعة (الفاو) لعام 2021. وتزرع الطماطم داخل الصوب وخارجها وكذلك في الزراعات السلكية أو الأرضية.
وتصاب الطماطم بالعديد من الأمراض سواء فطرية ، فيروسية وبكتيرية كما تصاب بالفيتوبلازما والفيرويدات والنيماتودا والحشرات. وتصاب الطماطم بالعديد من الحشرات مثل المن والذباب الأبيض والتربس وكذلك بعض الحشرات حرشفية الأجنحة والأكاروسات وتكمن خطورة الإصابة الحشرية في نقل العديد من الفيروسات النباتية التي تسبب ضررا اقتصاديا كبيرا كميا ونوعيا حيث تصاب الطماطم بأكثر من 70 فيروسا نباتيا علي مستوي جميع أنحاء العالم.
وتصاب نباتات الطماطم بفيروسات عديدة تختلف شدة إصابتها من فيروس لآخر، ومن بين تلك الفيروسات فيروس إصفرار وتجعد أوراق الطماطم ( TYLCV ) وكذلك فيروس كلوروسيس الطماطم ( ToCV ) ويتشابه كلا الفيروسين في مظاهر الإصابة الخارجية لدرجة يصعب علي غير المتخصصين التفرقة بينهم بناءا علي الأعراض الخارجية. ويعتبر فيروس إصفرار وتجعد أوراق الطماطم ( TYLCV ) من أخطر الفيروسات التي تصيب نباتات الطماطم حول العالم وذلك عن طريق حشرات الذباب الأبيض. وينتمي الفيروس إلي مجموعة الـ Giminiviridea. ولقد حظي فيروس TYLCV بقدر كبير من الإهتمام والدراسة لما يحدثه من خسائر إقتصادية كبيرة قد تصل إلي عدم الحصول علي ثمار المحصول. أما فيروس كلورسيس الطماطم والتابع لمجموعة الـ Tobamoviridea فلم ينل القدر الكافي من الدراسة وذلك لتداخل أعراض الإصابة به مع فيروس TYLCV ومن هنا جاء الهدف الأول من الدراسة وهو تسليط الضوء علي فيروس كلورسيس الطماطم لدراسة خواص وصفات الفيروس في محاولة لمقاومته وتقليل الأضرار الناتجة عن الإصابة به.
وقد قسمت الرسالة لثلاث أقسام رئيسية ، وكان القسم الأول منها هو عزل وكشف وتعريف فيروسي الـ TYLCV و ToCV . وقد بدأت الدراسة في القسم الأول بإجراء حصر لتواجد فيروس كلورسيس الطماطم في المحافظات المنتشر بها زراعات الطماطم وتم تجميع العينات اعتمادا علي الأعراض الخارجية والتي تظهر في صورة إصفرار علي الاوراق السفلية للنباتات وظهور أعراض التبقع وشفافية العروق. تم تجميع عدد 600 عينة اعتمادا علي المظاهر السابقة وذلك خلال موسم واحد من العروة الشتوي من ست محافظات ( بني سويف، القليوبية، الجيزة ، الإسماعيلية ، المنوفية والفيوم) لكل موسم. وقد اتضح من النتائج أن نسبة تواجد الفيروس في موسم عام 2020 و عام 2021 كانت 25 إلي 35 و 22 إلي 40 % علي التوالي. وتمثلت أعلي نسبة تواجد في العينات التي تم تجميعها من محافظة المنوفية وذلك بنسبة 40 % يليها العينات التي تم تجميعها من محافظة الإسماعيلية وذلك بنسبة 35 % وذلك في عامي 2021 و 2020 علي التوالي. بينما سجلت محافظة بني سويف أقل نسبة تواجد للإصابة بنسبة 22 % . وكانت معدلات الإصابة في عام 2021 أعلي من معدلات الإصابة في عام 2020.
تم عزل كلا من فيروس TYLCV و فيروس ToCV والكشف عن تواجدهم في 11 عينات تم تجميعها من ستة محافظات مختلفة ( بني سويف، القليوبية، الجيزة ، الإسماعيلية ، المنوفية والفيوم) واستخدم في الكشف كلا من اختبار الإليزا وتكنيك تفاعل البلمرة المتسلسل.وأظهرت النتائج ان 4 عزلات من إجمالي 11 عزلة (عزلة محافظة القليوبية ،الاسماعيلية ،المنوفية والفيوم) أعطوا نتيجة موجبة مع فيروس TYLCV. في حين أعطت العينات الأخري نتيجة سلبية مع فيروس TYLCV . وعلي الجانب الآخر أعطت جميع العينات نتيجة إيجابية مع فيروس ToCV بإستثناء عزلة محافظة الفيوم والتي أعطت نتيجة سلبية مع الفيروس.
إستخدم تكنيك تفاعل البلمرة المتسلسل واستهدفت التجربة جين الغلاف البروتيني (CP) وجين الصدمة الحرارية ( HSP70) للكشف الجزيئي عن فيروسي الـ TYLCV و ToCV . وتم التحصل علي حزمة بوزن 550 و 438 زوج من القواعد لفيروسي الـ TYLCV و ToCV علي التوالي.
تم إكثار جين الغلاف البروتيني (CP) وجين الصدمة الحرارية ( HSP70) وذلك لدراسة التتابع النيوكليوتيدي لفيروسي الـ TYLCV و ToCV بواسطة تكنيك Next Generation Sequencing كما تم دراسة درجة القرابة مع العزلات الأخري المسجلة علي بنك الجينات.
أُجري أكثار لفيروس كلورسيس الطماطم مع متابعه تطور أعراض الإصابة علي النباتات المصابة ومن نتائج التجارب تم ملاحظة أن الفيروس يسبب أعراض مختلفة علي النباتات الطماطم مثل ظهور عروق داكنة ، عروق خضراء داكنة ، عروق صفراء علي الأوراق المصابة وتجعد وتشوه الأوراق.
دُرست الخصائص الموروفولوجية لفيروس كلورسيس الطماطم بواسطة الميكروسكوب الإلكتروني ، تبين من نتائج الفحص ان الفيروس يمتلك جزيئات ذات شكل خيطي أو عصوي مرن.
تم فحص التأثيرات الخلوية المرضية التي يحدثها الفيروس داخل الخلايا بالميكروسكوب الإلكتروني النافذ بإستخدام تكنيك القطاعات المتناهية الرقة وكذلك بالميكروسكوب الضوئي ، وقد أوضحت النتائج وجود تغيرات سيتولوجية في خلايا النباتات المصابة بالفيروس بعد 45 يوم من العدوي وتمثلت في حدوث تغيرات بالفجوات والنواة وطبقة الكلوروبلاست وطبقة الإبيديرم والميزوفيل وطبقة اللحاء مقارنة بالنباتات السليمة.
كما دُرس المدي العوائلي لفيروس كلورسيس الطماطم علي 26 نوع نباتي ينتموا إلي ثمانية عائلات مختلفة وأوضحت النتائج أن عدد 24 نوع نباتي أظهروا حساسية مختلفة للإصابة الفيروسية والتي ظهرت في صورة أعراض خارجية علي النباتات المصابة.
عند دراسة كفاءة إنتقال فيروس ToCV بواسطة الذبابة البيضاء علي نباتات الطماطم وسبق ذلك تعريف لنوع الذبابة البيضاء ( Bemisia tabaci ) بقسم وقاية النبات- كلية الزراعة – جامعة عين شمس وأثبتت النتائج أن عملية النقل تمت بكفاءة حيث نقلت 15 حشرة من الذبابة البيضاء الفيروس بكفاءة ترواحت نسبتها من 35-45 % مع تحقيق أقصي قدر من الكفاءة بعد 48 ساعة كما أوضحت التجارب أنه يمكن للذباب الأبيض التمييز بين الفيروسين ( TYLCV & ToCV ) أثناء عملية الإكتساب. وعند تجربة طريقة الحقن بالسرنجة كطريقة من طرق الإنتقال تم حدوث عدوي لنباتات الطماطم بطريقة الحقن بالسرنجة ولكن لوحظ أن كفاءة عملية إنتقال الفيروس بحشرات الذبابة البيضاء أعلي من طريقة الحقن بالسرنجة. ولقد تم إختبار كفاءة عملية النقل في الطريقتين بالكشف عن الفيروس بواسطة الأعراض الخارجية للفيروس وكذلك إختبار الإليزا وتكنيك البلمرة المتسلسل.
في القسم الثاني من الدراسة تم دراسة التسلسل الكامل لجينوم فيروس كلورسيس الطماطم، ولقد تم أولا دراسة التحليل الجيني الجزيئي لجين HSP70h لعزلة الفيروس المصرية وتسجيله علي بنك الجينات. كما تم دراسة درجة القرابة ونسبة التشابه بين العزلة الفيروسية والعزلات المسجلة علي بنك الجينات وأظهرت نتائج درجة القرابة تباينا وراثيا محدودا بين العزلة الفيروسية والعزلات الأخري الموجودة علي بنك الجينات. وسجل أقل تشابه وراثي مع العزلة الصينية بنسبة 81 % في حين سجلت أعلي نسبة تشابة وراثي مع العزلة الإيطالية حيث بلغت نسبة التماثل 99 %.
تلي ذلك دراسة التسلسل النيوكليوتيدي الكامل لعزلة فيروس كلورسيس الطماطم وتم إجراء هذا التكنيك بمعرفة شركة ماكروجين بدولة كوريا وذلك بإستخدام برنامج DNAMAN في التحليل . وأوضحت التحليلات الجزيئية أن الجينوم الكامل لفيروس كلورسيس الطماطم والذي يتبع جنس Crinivirus يتكون من جزيئين من الحامض النووي RNA وهما RNA1 و RNA2 وهما مسئولين عن تضاعف الفيروس وحماية الجينوم. ولوحظ وجود اختلاف بسيط في الحجم بين RNA1 و RNA2 وهذا الإختلاف يشير إلي هجرة -ss و ds-RNA كحزمة فردية منتشرة أثناء التحليل.
كما أوضحت النتائج إحتواء المكون RNA1 علي 302 نيوكليوتيدة كما ان هذا التركيب يحتوي علي تتابع غير مترجم ولديه أثنين من الـ Open Reading Frame (ORFS) والمسئولة عن تشفير البروتينات المشاركة في تضاعف الحامض النووي .الـ ORF الأولي للمكون RNA1 وهو ORF 1 a والتي تشفر إلي بروتين ذات وزن جزيئي 221 كيلودالتون ويعتبر هذا البروتين من البروتينات الشائعة بين أفراد عائلة الـ Closteroviridae وهذا البروتين مسئول عن الإنزيمات Proteases، Methyltransferase and Helicase . اما الـ ORF الثانية للمكون RNA1 وهو ORF 1 b والذي يشفر إلي RNA dependent RNA Polymerase (RdRp) بوزن جزيئي 59 كيلودالتون وهو مكون ثابت بين اعضاء جنس Crinivirus .أما ORF 2 فهو يقوم بتشفير بروتين ذو وزن جزيئي 22 كيلو دالتون وهو بروتين ذو وظيفة غير معروفة كما أنه أظهر نسبة تماثل قليلة مع البروتينات الاخري المسجلة في قاعدة بيانات بنك الجينات مما يشير إلي أنه مكون فريد ومميز في هذه العزلة.
كما أوضحت النتائج احتواء الطرف الثالث من المكون RNA1 علي ORF صغير مشابه للبروتينات الموجودة في الطرف الثالث من فيروسات جنس Crinivirus الأخري الموجودة علي بنك الجينات.
علي النحو الآخر وجد أنه عند تحليل المكون RNA2 احتواءه علي 238 نيوكليوتيدة وهو يحتوي علي ORF 1 الذي يشفر إلي بروتينا صغيرا بوزن 4 كيلو دالتون وهو من البروتينات الكارهة للماء مما يشير إلي أنه قد يعمل كبروتين عبر الغشاء السيتوبلازمي. وتحتوي الفيروسات الأخرى التابعة لجنس الـ Crinivirus علي بروتينات مماثلة الحجم ولها نفس خاصية الكارهية للماء. أما عن ORF 2 فلقد أوضحت تحليلات النتائج أنه يقوم بتشفير بروتين الصدمة الحرارية HSP70h والذي من المحتمل أنه يرتبط بالفريونات من نهايتها كما أنه يشارك في تجميع الفريونات وحركتها من خلية إلي أخري. أما عن الـ ORF 3 و ORF 4 فأثبتت التحليلات أنهما يشفران عن بروتينات بوزن جزيئي 8 كيلودالتون وذلك علي غرار فيروس اصفرار البنجر الكاذب وفيروس الفراولة الشاحبة. أما ORF 5 فهو يشفر بروتينا بوزن 9 كيلودالتون بينما ORF 6 و ORF 7 يشفر عن بروتينات الغلاف الرئيسية والثانوية ( CP و CPm ).
وأوضحت التحليلات أن البروتين P27 يعتبر بروتينا فريدا بالنسبة لفيروس كلورسيس الطماطم عند مقارنته بالبروتينات المسجلة علي بنك الجينات. وأوضحت النتائج إرتباط فيروس كلورسيس الطماطم إرتباطا وثيقا بفيروس التقزم الأصفر في البطاطا الحلوة . وتم تسجيل أثني عشر جينا في بنك الجينات وتم أعطاء أرقام تسجيل مخصصه لها علي بنك الجينات.
يهدف القسم الثالث من الدراسة إلي مقاومة فيروس كلورسيس الطماطم بإستخدام الجسيمات النانوية كمضادات للفيروسات، وتم استخدام نوعان من الجسيمات النانوية وهما السيليكا والزنك المحملان على الكيتوزان
ولذلك بحثت الدراسة في إمكانية الجسيمات النانوية في السيطرة على ToCV في نباتات الطماطم. تم تطبيق الجسيمات النانوية كعامل مضاد للفيروسات وعامل مبيد للفيروسات، مما يقلل من عدوى ToCV، وشدة المرض، وتركيز الفيروس. أظهرت النتائج أن المواد الكيميائية النباتية، بما في ذلك البروتين الكلي، وأنشطة الإنزيمات المؤكسدة، وأصباغ التمثيل الضوئي، وحمض الساليسيليك، زادت بشكل كبير من مقاومة ToCV في نباتات الطماطم المعالجة بـ-Ch@SiO2NPs وCh@ZnO2NPs مقارنة بالطماطم المعالجة مسبقًا. يشير هذا إلى أن تكنولوجيا النانو وإدارة الآفات البيولوجية يمكن أن تكون بمثابة تحسن في المكافحة الكيميائية لمكافحة الأمراض النباتية.
وجدت الدراسة أن علاج CH@SiONPs قد حفز بشكل فعال تعبير البروتين -1 PR-1 المرتبط بالتسبب في المرض في نباتات الطماطم. أظهر العلاج التطبيقي المزدوج Ch@ZnO2NPs (TZB) و (TZA) أفضل النتائج، مع مستويات تعبير أعلى من العلاج (H). أظهر علاج ToCV انخفاضًا طفيفًا في تعبير PR-1. تم تنظيم تعبير البروتيناز PR-7 بشكل ملحوظ في نباتات الطماطم الملقحة بـ ToCV. أظهر علاج ToCV التنظيم الأكثر أهمية للتعبير β-1،3-glucanase PR-2. ومع ذلك، أظهرت مجموعات العلاج Ch@SiO2NPs انخفاضات كبيرة في مستويات النسخ PR-2.
التوصية
دعمت النتائج فكرة أن ToCV قد يؤدي إلى تأثيرات مرضية تآزرية على العوائل الطبيعية. ينبغي اتخاذ احتياطات صحية صارمة، مثل أ) إزالة العوائل الطبيعية و ب) السيطرة على الفيروس، و ج) بالإضافة إلى ذلك، يجب معالجة مشكلات انتقال النواقل. ووفقا لهذه الدراسة، قد تساعد الجسيمات النانوية في تحفيز نمو النبات وتكون بمثابة مصدر لعوامل التحكم لمكافحة عدوى فيروسات النبات.