الفهرس 
IntroductionOnly 14 pages are availabe for public view
 |  | from | 272 |  |  |
| | | from | 272 | | |
Abstract
الملخص العربي
” دراسات على الفعالية المضادة للميكروبات لبعض العزلات البكتيرية تجاه البكتيريا سالبة الجرام المنتجة للبيتا لا كتاميزز ممتدة الطيف”
تناولت هذه الدراسة عزل مائة وثلاثة وسبعون عزلة بكتيرية من عينات من التربة التي تم جمعها من مختلف المحافظات المصرية والتي اظهرت الصفات الظاهرية المميزة لبكتريا الاستربتوميسيس. ولذلك تم فحص العزلات المجمعة لنشاطها المضاد للميكروبات ضد سلالة مرجعية منتجة للبيتا لاكتاميزز ممتدة الطيف وهي عزلة الكليبسيللا نيموني المرجعية ATCC 700603 باستخدام طريقة الأجارالقابس ، وقد وجد أن ثلاثين عزلة لها نشاط مضاد للميكروبات ضد السلالة المختبرة.بالاضافة الي ذلك تم فحص العزلات الثلاثين الإيجابية لنشاطها المضاد للميكروبات ضد نفس السلالة المرجعية وضد ثلاثة عزلات بكتيرية مختلفة ممرضة عن طريق اختبار الانتشار القطري باستخدام طافي النمو الخالي من الخلايا وكانت هذه العزلات تأوي جينات مختلفة مقاومة للبيتا لاكتاميزز ممتدة الطيف.
وقد تبين ان عزلات الاستربتوميسيس المختبرة لها مستويات مختلفة من النشاط المضاد للميكروبات مع وجود عشر عزلات فقط ذات نشاط مضاد لجميع البكتيريا المختبرة والمنتجة للبيتا لاكتاميزز ممتدة الطيف كما يتضح من أقطار مناطق التثبيط التي تم الحصول عليها. ومن بين هؤلاء، أظهرت عزلتان وهما استربتوميسيس رقم W2 و رقم H21 أكبر مناطق تثبيط ضد جميع السلالات المنتجة للبيتا لاكتاميزز ممتدة الطيف المختبرة. وقد تم اختيار هاتين العزلتين لاستكمال هذه الدراسة، وعند الحاجة تم اختبار النشاط المضاد للميكروبات لهاتين العزلتين المختارتين باستخدام سلالة الكليبسيللا نيموني المرجعية ATCC 700603.
تم تعريف عزلتي الاستربتوميسيس المختارتين رقمي W2 و H21 باستخدام تحليل التتابع النيوكليتيدي لجين الحامض النووي الريبوسومى ال16S لكليهما علي انهما ااستربتوميسيس فولفيسيموس ( عزلة رقم W2) , و استربتوميسيس منيبيورينسيس (عزلة رقم H21 ).وتم
ايداع التتابع النيوكليتيدي الجيني للسلالتين في قاعدة بيانات بنك الجينات تحت رقمي MH036743 و MH036744 على الترتيب. أيضا ، تمت دراسة بعض الخصائص الفسيولوجية والكيميائية الحيوية لكلتا العزلتين ووجد ان كليهما له القدرة علي تحليل النشا القابل للذوبان والكازيين.كما أظهرت كلتيهما نموًا جيدًا عند درجة اس هيدروجيني من 5 إلى 9.علاوة على ذلك ، أظهرالفحص الخارجي للبوغ وخصائص سلسلة البوغ باستخدام المجهر الإلكتروني وجود خصائص الاستربتوميسيس.
أيضا أظهر نمط الحساسية للمضادات الحيوية لعزلة ستربتوميسيس فولفيسيموس W2 حساسية تجاه الأميكاسين ، سيبروفلوكساسين ، دوكسي سيكيلين ، إريثروميسين ، إرتابينيم ، جنتاميسين ، ليفوفلوكساسين ، لاينزوليد ، ميروبينيم وفانكومايسين ومقاومة تجاه الأموكسيسسيللين ،ازيثروميسين ، كليندامايسين ، الكوأموكسيكلاف ، الكوتريموكسازول وإيميبينيم. ومع ذلك ، فقد أظهرت عزلة الاستربتوميسيس منيبيورينسيس H21 حساسية تجاه الأميكاسين ، الأزيثروميسين ، السيفوكسيتين ، سيبروفلوكساسين ، الدوكسي سيكلين ، الإريثروميسين ، الجنتاميسين ، الليفوفلوكساسين ، لاينزوليد والفانكومايسين ومقاومة تجاه الأموكسيسيلين ،الازتيريونام ،السيفيبيم، السيفرتاكسيم ، السيفتازيدم ، السيفترياكسون ، يميكسيمين ، الكليندامايسين ، الكوأموكسيكلاف ، الكوتريموكسازول وإيميبينيم.
بالاضافة الي ذلك،تم دراسة تأثير العوامل المختلفة على نمو وإنتاج مضادات الميكروبات بواسطة العزلتين المختارتين في التخمير المغمور في القوارير الهزازة باستخدام عامل واحد في كل مرة و باستخدام منهجية استجابة السطح (RSM). تمت دراسة ثلاثة متغيرات ؛وهي فترة التحضين ، ودرجة حرارة التحضين و وسط النمو. كما تم استخدام الظروف المثلى التي تم الحصول عليها في نموذج منهجية استجابة السطح.
بالنسبة لكلتا العزلتين ، فقد ثبت ان فترة التحضين المثالية تبلغ 72 ساعة لانتاج مضادات الميكروبات. وقد لوحظ ان الإنتاجية القصوى في درجة حرارة التحضين تظهر عند 28 درجة مئوية. كما ثبت ان وسط فول الصويا (M1) هو الأفضل والأرخص. ومن ثم فقد تم استخدام هذه العوامل في نموذج طريقة تصميم العوامل التجريبي وتحليل طريقة منهجية استجابة السطح بتركيزات تدعم اقصي انتاجية.
وفي حالة عزلة الستربتوميسيس فولفيسيموس رقم W2 تم تشييد نموذج من 32 تجربة وكانت قيمة معامل الارتباط المتعدد 0.85. وقد اظهر الإنتاج باستخدام الظروف المحسنة للتحضين لمدة 72 ساعة عند 28 درجة مئوية باستخدام معدل التقليب 250 دورة في الدقيقة وحجم اللقاح البكتيري بنسبة 4 ٪ حجم/ حجم بالاضافة إلى درجة الاس الهيدروجيني 8.33 الي زيادة بمقدار 1.7 ضعف في إنتاج مضادات الميكروبات مقارنة بالإنتاج تحت الظروف غير المحسنة.
اما بالنسبة لعزلة الاستربتوميسيس منيبيورينسيس رقم H21 ،فقد تم تشييد نموذج من 23 تجربة وبلغت قيمة معامل الارتباط المتعدد 0.925. وقد اسفر استخدام الظروف المحسنة للتحضين لمدة 72 ساعة عند 28 درجة مئوية باستخدام معدل التقليب 250 دورة في الدقيقة وحجم اللقاح البكتيري بنسبة 2.75 ٪ حجم/ حجم ودرجة الاس الهيدروجيني 7 عن زيادة زيادة بمقدار 2 ضعف في إنتاج مضادات الميكروبات (قطر منطقة التثبيط 28 مم) مقارنة بالإنتاج في ظل ظروف غير محسنة (قطر منطقة التثبيط 26مم).
كما اتضح من ااختبار النيتروسيفين اللوني ان كلتا العزلتين المختارتين ليست لديهما القدرة علي انتاج اي مثبط لانزيمات البيتا لاكتاميزز ممتدة الطيف. فيما لوحظ ان النشاط المضاد للميكروبات لعزلة الاستربتوميسيس منيبيورينسيس رقم H21 تجاه سلالة الكليبسيللا نيموني المرجعية ATCC 7006033 المنتجة للبيتا لا كتاميزز ممتدة الطيف يشمل المحتوي داخل و خارج الخلايا بينما اظهرت عزلة الستربتوميسيس فولفيسيموس رقم W2 نشاطها خارج الخلية فقط.
شمل النشاط المضاد للميكروبات لطافي النمو الخالي من الخلايا للعزلتين المختارتين مجالات مختلفة ضد الكائنات الحية المختبرة. حيث أظهرت عزلة الستربتوميسيس فولفيسيموس رقم W2 نشاطًا قويًا مضادا للميكروبات (قطر منطقة التثبيط ≥ 30 مم) ضد 7 من أصل 10 و 4 من أصل 6 كائنات سلبية سالبة الجرام وموجبة الجرام ، على التوالي. وأعطت قطر منطقة تثبيط للنمو يتراوح بين 20-30 مم ضد كانديدا باراسيلوسيسATCC 22019 ، كانديدا كروسي ATCC 14243 و كريبتوكوكس نيوفورمانس RCMB 0049001 ولم يكن لها اي نشاط ضد بقية الفطريات المختبرة. فيما ، أظهرت عزلة الاستربتوميسيس منيبيورينسيس رقم H21 نشاطًا قويًا (قطر منطقة تثبيط ≥ 30 مم) ضد البروتيس فالجاريس ATCC 33420 و ستافيلوكوككس ATCC 49907 ونشاطا متوسطا (قطر منطقة تثبيط : 20-30 مم) ضد البكتيريا الموجبة والسالبة الجرام المختبرة الأخرى. وأظهرت نشاطا مضادا للفطريات ضد جميع الفطريات المختبرة.
اظهر النشاط المضاد للميكروبات لعزلات الستربتوميس المختارة ثباتا حراريا فيما تسبب كلا من الغليان عند درجة الحرارة 100 درجة مئوية (لمدة 30 دقيقة) و التعقيم (121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة) في محو الفعالية كمااتضخ من عدم وجود مناطق تثبيط للنمو بالمقارنة مع العينة الضابطة. يمكن للعامل المضاد للميكروبات الذي تم إنتاجه بواسطة العزلات المستخدمة أن يتحمل درجة اس هيدروجيني تصل إلى 9 دون فقدان الفعالية فيما لم يتم العثور على أي تغيير في الفعالية في حالة المعالجة ببروتيناز K أو التربسين.
و لم يكن هناك تاثيرا للمعادن ثنائية التكافؤ ، ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الأسيتيك و دوديسيل كبريتات الصوديوم علي نشاط عزلة الستربتوميسيس فولفيسيموس رقم W2 فيما تسبب الحديد ثنائي التكافؤ 10(ملي مولار )والزنك (10و1 ملي مولار) في فقد 15 و 7 ٪ من نشاط مضادات الميكروبات تجاه سلالة الكليبسيللا نيموني المرجعية ATCC 7006033 المنتجة للبيتا لا كتاميزز ممتدة الطيف.
وفد استخدمت طرق استخلاص مختلفة كمحاولة لتنقية العوامل المضادة للميكروبات من طافي النمو الخالي من الخلايا للعزلتين المختبرتين. تم اختبار جميع المستخلصات لنشاطها المضاد للميكروبات ضد السلالة المرجعية المنتجة للبيتا لا كتاميزز ممتدة الطيف سلالة الكليبسيللا نيموني المرجعية ATCC 7006033 باستخدام اختبار الانتشار القطري. وشملت هذه الطرق الاستخلاص من طافي النمو الخالي من الخلايا السائل ، الاستخلاص المتسلسل لـطافي النمو الخالي من الخلايا السائل بواسطة مذيبات عضوية متعددة ، الاستخلاص من طافي النمو الخالي من الخلايا المجفف ، والاستخلاص من طافي النمو الخالي من الخلايا المجفد. وكشفت النتائج أن الاستخلاص باستخدام الميثانول من طافي النمو الخالي من الخلايا المجفد يمكن ان يستخلص العوامل المضادة للميكروبات لعزلتي الاختبار بدرجة معقولة. وقد تم اختبار النشاط المضاد للميكروبات لمستخلصات طافي النمو الخالي من الخلايا المجفدة لكل من عزلة الستربتوميسيس فولفيسيموس رقم W2 وعزلة الاستربتوميسيس منيبيورينسيس رقم H21 باستخدام اختبار الانتشار القطري واظهرت النتائج منطقتي التثبيط للنمو بقطرين 28 ± 0 و 20 ± 0.5 مم ، على الترتيب.
أظهر كروماتوجرام الطبقة الرقيقة لعزلة الستربتوميسيس فولفيسيموس رقم W2 عند الكشف باستخدام الأشعة فوق البنفسجية نطاقات منفصلة عند استخدام أسيتات إيثيل: ميثانول بنسبة 70:30 وأيضًا عند استخدام كبريتات الفانيلين أو نينهيدرين. ومع ذلك ، لم يلاحظ وجود أي فصل (وجود أشرطة منفصلة) في حالة خلات الإيثيل: ميثانول 60:40. وتم اخضاع كروماتوجرام الطبقة الرقيقة للتصوير الحيوي .وعلاوة علي ذلك أظهر الرسم البيولوجي لمستخلص الميثانول لطافي النمو المجفد الخالي من الخلايا لعزلة الاستربتوميسيس فولفيسيموس رقم W2 بقعا واضحة للتثبيط على ألواح الاجار الملقحة سطحيا ؛كما تم تحديدها بوضوح في موقع التحميل وعلى الطرف الآخر من اللوح.
وعلي النحو الاخر أظهر كروماتوجرام المستخلص الميثانولي لطافي النمو المجفد الخالي من الخلايا لعزلة الاستربتوميسيس منيبيورينسيس رقم H21 فصالا ضعيفا عند استخدام خلات الإيثيل: ميثانول 60:40 و 70:30. وفي الرسم البيولوجي لم يظهر مع أسيتات إيثيل: ميثانول 70:30 أي مناطق تثبيط على سطح الواح الاجار الملقحة.
تم تحميل مستخلصات الميثانول النشطة لطافي النمو الخالي من الخلايا المجفد على أقراص معقمة واختبارها مقارنة ببعض أقراص المضادات الحيوية التجارية (MEM ، AMC و A / S)حيث أظهر المستخلص (50 مجم / مل) من عزلة الستربتوميسيس فولفيسيموس رقم W2 منطقة تثبيط 15 مم ، بينما أعطى مستخلص عزلة الاستربتوميسيس منيبيورينسيس رقم H21 منطقة تثبيط 18 مم. بالإضافة إلى ذلك ، تم اختبار هذه المستخلصات ابطريقة انتشار القرص. وقد ثبت وجود نشاط مضاد للفطريات ضد الكانديدا باراسيلوسيس ATCC 22019 في حالة عزلة الستربتوميسيس فولفيسيموس رقم W2 و ضد الكانديدا لويستانيا في حالة عزلة الاستربتوميسيس منيبيورينسيس رقم H21. و كان قطري منطقة تثبيط النمو الذين تم الحصول عليهما في كلتا الحالتين 11 و 10 مم ، وتبين عدم وجود نشاط ضد بقية الفطريات المختبرة الأخرى.
تم التوصل لتركيزات الحد الأدنى المثبط للنمو من مستخلصات الميثانول لطافي النمو الخالي من الخلايا المجفد لعزلة الستربتوميسيس فولفيسيموس رقم W2 و عزلة الاستربتوميسيس منيبيورينسيس رقم H21 ضد كليبيسيللا نيموني ATCC 700603 ليكون 3.125 و 5 مجم / مل ، على الترتيب. وتركيزات الحد الأدنى القاتل للبكتيريا من تلك المستخلصات المذكورة لتكون 12.5 و 10 مجم / مل ، على الترتيب.
كما تبين قوة السمية الخلوية لطافي النمو الخالي من الخلايا لعزلة الستربتوميسيس فولفيسيموس رقم W2 (كانت نسبة السمية الخلوية 95٪) ، في حين لوحظ أن السمية الخلوية متوسطة (62٪) لطافي النمو الخالي من الخلايا لعزلة الاستربتوميسيس منيبيورينسيس رقم H21. وأظهر مستخلص الميثانول لطافي النمو الخالي من الخلايا المجفد لعزلة الستربتوميسيس فولفيسيموس رقم W2 نشاطا سميا ضد خط خلايا السرطان Caco-2 (CD50 = 5.04 ميكروجرام / مل) و علي الصعيد الاخر، فإن مستخلص الميثانول لطافي النمو الخالي من الخلايا المجفد لعزلة الاستربتوميسيس منيبيورينسيس رقم H21 لم يظهرله اي نشاطا سميا للخلايا بخارج العائل (CD50 = 1170 ميكروجرام / مل) .